入门指导

DNA测序仪原理和方法

DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。

【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。

由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

【试剂与器材】

1.BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。

2.pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L,试剂盒配套试剂。

3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。

4.DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。

5.引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。

6.灭菌去离子水或三蒸水。

7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离,PE公司产品。

8.3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。

9.70%乙醇和无水乙醇。

10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。

11.POP 6测序胶 ABI产品。

12.模板抑制试剂(TSR) ABI产品。

13.10×电泳缓冲液 ABI产品。

14.ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。

15.2400型或9600型PCR仪

16.台式冷冻高速离心机。

17.台式高速离心机或袖珍离心机。

【操作步骤】

1.PCR测序反应

(1) 取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:

所加试剂 测定模板管 标准对照管

BigDye Mix


1μl

1μl

待测的质粒DNA


1μl

pGEM-3Zf (+) 双链DNA

- 1μl

待测DNA的正向引物

1μl

M13(-21)引物 - 1μl

灭菌去离子水   2μl

2μl

总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。

(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。

2.醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。

(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1) 加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心。

(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min),冰中骤冷,待上机。

4.上机操作 按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养

【计算】

测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%

差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。

注意事项与评价】

1.ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。

2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。

3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。

4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。


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