入门指导

PCR新手指南

PCR的基本概念

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)是一种分子生物学技术,用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术主要过程是,通过人类合成的一小断单链DNA片段(叫做引物)与模板DNA特定的区域特异性结合,进而以四种dNTP为底物,通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中,最重要的是热稳定的DNA聚合酶,由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定,所以我们可以通过94~97度这个温度范围内处理DNA形成单链,然后降温(根据引物不同而有差异,一般为50-55度)直至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度,

聚合酶聚合形成双链DNA。

经典方法

PCR体系组分

DNA模板(template),含有需要扩增的DNA片断。

2个引物(primer),决定了需要扩增的起始和终止位置。

DNA聚合酶(polymerase),复制需要扩增的区域。

脱氧核苷三磷酸(dNTP),是指4种脱氧核糖核酸,用于构造新的互补链。

缓冲体系,提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

H2O 为了保持各个组分的浓度,在体系中加水稀释

注意:部分品牌缓冲液不含有Mg2+,那么还需要添加对应浓度的Mg2+。酶请最后加入,水请最先加入。

PCR步骤

1. DNA变性

(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA。

2. 退火

(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

3. 延伸

(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。

PCR的循环参数

1. 预变性(Initial denaturation)

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2. 循环中的变性步骤

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

3. 引物退火(Primer annealing)

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4. 引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略 延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5. 循环数

大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

6. 最后延伸

在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。

结果分析

1、假阴性,不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及,④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

2、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

4、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量,减少循环次数。

方法视频

BLAST - PCR引物设计

BLAST - PCR引物设计

PCR纯化

PCR纯化

PCR技术的新进展及其应用

PCR技术的新进展及其应用

问答

Q1.PCR各组分应该按照什么顺序怎么添加?

A 水-buffer-dNTP或Mg+-酶,分装,模板。

Q 2.要如何设计对照实验?

A PCR一般要设两个对照:

阳性对照:用比较容易扩增出来的体系。比如以前次次都可以扩出来的体系,也可以用16s的,因为这个最好扩。

阴性对照:就是你本次扩增的目的体系不加Taq酶即可。

Q 3.PCR产物是否需要用凝胶纯化?

A 如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

Q 4.模板浓度越高越好吗?

A 模板浓度不是越高越好,有时候会适得其反


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